当袁绍与曹操在官渡相持之际，江东的孙策也刚刚吞并豫章，并一直密切注视着中原的局势，不过，孙策迫切需要解决的是江北的扬州刺史严象和广陵太守陈登。孙策回到吴郡后，即派遣部将进攻陈登的匡琦城（确址不详，当在今江苏省淮安市附近）。孙策军队进抵匡琦城下，陈登的下属都说：“孙策军队十倍于我，恐怕难以抵挡，不如弃城躲避，江东军队擅长水战，离开水面来到陆地，必定不会久留。”陈登严厉呵斥道：“我身受朝廷之命镇守此地，过去马援也曾担任伏波将军一职，能南平百越，北扫群狄，既然我不能扫除群顽，岂能望风而逃！我奉王命以讨伐叛逆，天道助顺，一定能击败敌人！”遂闭城固守，示弱与敌，却在城内厉兵秣马，等到黎明时分，陈登下令大开城门，以步兵向孙策军队正面发起冲锋，以骑兵迂回到敌人背后截击。孙策部将周章所部被阻挡在岸上，无法返回船上，遂被陈登斩杀俘虏上万人。失败后，孙策大怒，又增派军队卷土重来，陈登自知不敌，遂派功曹陈矫向曹操求救。陈登偷偷在城外十里偷偷埋伏一支部队，携带很多柴草，每十步安放一堆。夜幕降临后，陈登下令点燃柴草，又让城内守军欢呼鼓噪，仿佛援军已到的样子。孙策军远远望见，信以为真，遂惊慌而逃，又被陈登斩杀了上万人。孙策派遣部将进攻陈登，并被陈登击败，应当是属实的，但史书记载的孙策军的伤亡人数肯定是有水分的。虽然陈登取得了守城战的胜利，但在孙策军的威胁下，不得不从射阳撤离，沿淮河西上，将治所迁至九江郡的东城县（今安徽省怀远县东南），曹操随即任命其为东城太守。前人对此有不同的看法：一种意见是陈登被任命的是兗州的东郡太守，史料将东城误记作东城；第二种意见是陈登就是被任命的东城太守，曹操将东城县升格了。陈登离开后，东吴遂占据了淮河以南之地。
据《三国志·刘馥传》记载，孙策任命的庐江太守又杀死了朝廷任命的扬州刺史严象，与此同时，当地的豪强梅乾、雷绪、陈兰等人也在江、淮间聚众数万人，四处劫掠。广陵郡功曹陈矫见到曹操后说：“我们郡虽小，但地理位置却非常重要，如果大人发兵救援，则江南人就会打消对中原的图谋，徐州也会安全，并让大人的威名远播。”曹操正与袁绍在官渡相持，哪有兵力南下？不过，孙策在江淮之间的动作，也引起了曹操的高度重视，他虽然抽不出兵力救援陈登，但还是任命掾属刘馥担任扬州刺史，将东南防务托付给了他。刘馥受命以后，单人匹马来到合肥（今安徽省合肥市，扬州刺史治所在东汉时期开始在历阳，后来迁到寿春，又迁到曲阿，至此又迁到合肥），安抚变民头领雷绪、陈兰等人，设立学校，实施屯田，兴修水利，数年之间有上万流民来到这里，合肥也成为淮南重镇。后来，魏明帝曾称：“献帝东置合肥，南守襄阳，西固祁山，贼来辄破于三城之下者，地必有所争也。”由此可知，合肥、襄阳、祁山分别是曹操集团和后来的曹魏帝国在东南、西南、西北的三个重镇。
孙策不甘心失败，他亲自率领大军来到丹徒（今江苏省镇江市），等待各地运来粮草，准备一举消灭陈登，并趁曹操与袁绍在官渡相持之际偷袭许都。如前所述，孙策在平定江东时，不管是江东大族还是豪强名士，只要是他感到威胁到了自己的统治，一概诛杀。《江表传》称，当时有位琅邪道士于吉住在东吴，用符咒给人治病，当地人对其非常敬重。一次，孙策召集手下文武宾客在城门上开会，于吉缓缓而来，孙策身边三分之二的下属见到于吉，都把孙策晾在一边，纷纷下楼迎拜，负责礼宾的官员制止不住。孙策见状大怒，当即下令将于吉逮捕。侍奉于吉的诸将让家中妇女前往孙策母亲吴夫人那里求情，吴夫人对孙策说：“于吉给军队祈福，又医治伤兵，不可杀。”孙策却说：“此人妖言惑众，令我手下文武不顾礼仪，竟然全离开我去迎候他，不能不杀！”遂将于吉处死了。过去，前吴郡太守许贡被孙策部将朱治驱逐，依附于严白虎，后来，许贡给汉献帝上书称：“孙策是一代枭雄，与项羽相似，朝廷应当授予其高官厚禄，将其征召到许都，他接到朝廷诏书就不得不回京，如果把他放在外面一定会成为祸患。”许贡的这封书信被孙策属下截获，孙策遂在平定严白虎后将其诛杀。许贡死后，他的门客潜伏在民间，一直想替主人报仇。孙策喜欢打猎，经常出营，他骑的骏马跑得很快，随从追赶不上。突然路上遇到三个人，就是许贡的奴仆，孙策问道：“你们是什么人？”三人回答：“是韩当的兵，在此射鹿。”孙策说：“韩当的兵我都认识，没有见过你们。”遂弯弓射杀一人，另外两人也弯弓射向孙策，一箭正中孙策脸颊。在万分紧急之中，孙策的随从恰好赶到，将剩余二人全部杀死。
《吴历》称，孙策受伤后，医生称能够治愈，只是要静养一百天。孙策拿起镜子，看到自己已经被毁容，对身边的人说：“脸成了这样子，岂能再建功立业？”顿时情绪非常激动，奋力推开茶几，脸上的伤口全部迸裂，很快就死掉了。《搜神记》则称：“策既杀于吉，每独坐，彷佛见吉在左右，意深恶之，颇有失常。后治创方差，而引镜自照，见吉在镜中，顾而弗见，如是再三，因扑镜大叫，创皆崩裂，须臾而死。”
建安五年四月四日，孙策在临死之前，对张昭等人说：“中原大乱，以吴越之众，三江之固，足以观察中原的成败，你们要好好辅佐我的弟弟。”《典略》称，孙策的三弟孙翊性格与孙策相似，张昭等人认为应以孙翊为继承人，但孙策没有同意，他把十九岁的二弟孙权唤到身边，把印绶交到他的手里，说道：“举江东之众，在两军阵前拼杀，与天下英雄争个高下，你不如我；然而，举贤任能，令各人都能尽心竭力保护好江东，我不如你！”《吴历》还记载，孙策又对张昭说：“如果仲谋没有能力，君可自取。一旦不能保有江东，就算是离开此地西去，从容投降朝廷，也没什么好担心的。”当天，孙策就死了，死时年仅二十六岁。孙策有一子三女，儿子孙绍继承吴侯爵位，三女，其一后来嫁给顾雍的儿子顾邵；其一嫁给朱治的二儿子朱纪；其一嫁给陆逊。孙绍的儿子孙奉在孙皓时被杀。