1598年，神父重返南京，由于朝鲜战争已经接近尾声，所以他在南京受到了热情接待，士大夫和勋贵们对他绘制的地图，还有机械仪器、几何图形表现出了越来越浓厚的兴趣。
利玛窦对儒家思想中的自然法则、理性法则表现出了浓厚的兴趣，所以相比程朱理学而言，他更推崇先秦儒家，因为先秦儒家更符合天道法则、理性法则，而程朱理学却强调个人对“天理”的理解与顿悟，推而广之，利玛窦对“心灵顿悟型”的道教与佛教也是排斥的。利玛窦在宗教文化上的不同理解自然在南京遭到了佛教徒的非议。
当时在南京住着一名有名望的僧人，他叫李本固，本是北京城的御史，因为上疏要求神宗册立东宫而被罢官，之后他放弃儒家信仰，出家为僧，一直住在南京。
李本固曾在跟儒生的一次辩论会上大谈佛家学说，贬低儒家学说，引起现场一位士大夫的不满，那位士大夫激动地说：“你对本土的儒家思想不加赞赏，反而推崇从外国流传进来的佛家思想，是何道理，利玛窦神父是西洋人，他不也信奉儒家吗？”
这位士大夫既然提到了利玛窦，李本固便邀请利玛窦前来与他辩论。
在一个有很多儒生的公开的场合，利玛窦首先发问：“请问你对造物主有什么看法？”
李本固回答道：“我并不否认有一位造物主存在，但我认为他并不是多么了不起。”
“造物主可以创造天地，你可以吗？”神父接着问。
“我也可以。”李本固答。
此时屋中有一火炉，利玛窦指着那火炉对李本固说道：“那你就造一个一模一样的火炉出来吧。”
“你这不是强词夺理吗？”李本固气愤地说道。
李本固接着又问道：“听说神父会占星，那么神父占星的时候是跑到天上呢？还是星星来到人间呢？”
“都不是。”神父说道。
“占星的时候只是依靠星星在我们头脑中的影像。”神父接着说。
李本固显得很兴奋，他跳了起来说道：“这就对了，用这样的办法，我就可以创造世间万物。”
利玛窦立刻反驳道：“我们心中的影像都是来自实物本身，难道说心中的影像就创造实物了吗？”
接下来，宴会开始，大家都落座，在场的儒生谈起了性本善，还是性本恶的问题，他们争论了半天也争论不出个所以然，利玛窦抛出了性本善的观点，这得到了儒生的一致赞同，但是李本固却提出了性本恶的观点，随后，李本固开始引用佛家经典。
利玛窦说道：“我们互不信奉对方教义，就不要引经据典了。”
随后，这场争论以无果而终，不过，看起来利玛窦似乎占了上风。这场争论其实所面对的焦点是“心性”问题，佛家教义提倡“心性”，而基督教义反对“心性”。基督教义认为人生下来就是有罪的，人要通过信耶稣来赎罪，这样人死后才能升到天堂；而佛家教义提倡人通过省悟来体会到“万物皆空”的道理，从而获得超脱。另外，我们从儒生们争论儒家思想早已定论的性本善、性本恶的问题可以发现，到了16世纪晚期，大明朝的儒生似乎对于儒家思想也产生了动摇。
1600年，在南京士大夫们和宦官的帮助下，利玛窦开始乘船沿着运河前往北京。在临清他遇到了宦官马堂，在山东的其他地方他还遇到了李贽。利玛窦将带给皇帝的礼品展示给马堂看，两幅绘在亚麻上的精美图画，一幅是救世主的，另一幅是圣母的，还有一架琴，一架自鸣钟和几个三棱镜。
因为有了太监，所以神父要来北京的消息迅速传递给了万历皇帝，万历同意神父来京，他对神父带来的这些玩意儿非常感兴趣，尤其是那座机械钟。皇帝将圣母玛丽亚的像赐给了他的母亲，由于李太后信佛教，她便把这图像束之高阁，听人说，无论是皇帝还是太后，都对西方的那种逼真画像感到不适应，这显然反映了东西方文化的差异。
皇帝和宫中的宦官们不懂这种机械钟如何使用，便让利玛窦手把手教宦官们如何使用，一直到教会为止。皇帝还不断派太监去向利玛窦询问欧洲的地理、饮食、文化、建筑、婚姻，当他听说欧洲的君主都居住在城堡中，每天都要上下楼梯，这位皇帝显得十分惊讶，他说道：“这不安全嘛，万一摔倒怎么办？”
皇帝不仅对西洋玩意儿感兴趣，他更想亲眼见见这位西洋传教士，但是自己已经有12年不接见大臣了，而且自己也曾说过除了太监、宫女外，他不见任何人，所以，这位脾气倔强的皇帝不能让自己食言，以给文官以口实。所以，他派人画了一幅利玛窦的等身像，皇帝看着利玛窦的画像，笑着说：“原来是个回人。”
利玛窦神父最后表示道，自己希望能够在北京传教，并死在这里，神父的请求无疑得到了万历皇帝的批准。
1610年，利玛窦逝世，神宗赐地安葬这位神父。从16世纪开始，这些西方的传教士不畏艰险，为了自己的理想而奋斗终身，更重要的是他们促进了东西方文化交流，无论对于西方，还是对于东方，这都是一件大事，它标志着东西方开始在思想上开始交流，而不仅仅是经济上。明代的士大夫们虽然对于基督教无法做的完全接受，但是他们保持了平等交流的心态，而且还有部分士大夫们开始信仰基督教，更为重要的是他们对于西方的机械、几何原理表示出了浓厚兴趣，利玛窦绘制的《坤舆万国全图》更令他们感到震撼。
从利玛窦与和尚的辩论中我们可以看出，基督和儒家同属“修身”类哲学，而道教、佛教、理学、心学则强调心灵的感悟，虽然在17世纪以后，儒学成了欧洲的时尚，而且还对启蒙运动产生了催化作用，但是不可否认的是，此时在中国，儒家思想却进入了死胡同，它正从理学、心学向隐学、实学转变。